Under gastroskopin bedövas svalget och vid behov ges premedicinering för att göra undersökningen så bekväm som möjligt. Ett vävnadsprov tas från slemhinnan i matstrupen om man ser förändringar i slemhinnan. Diagnosen bekräftas från vävnadsprovet. En ultraljudsundersökning (EUS) kan utföras under gastroskopin för att bedöma den lokala tillväxten av matstrupscancern.
En datortomografi av kroppen (DT) och ibland PET-undersökning (positronemissionstomografi), som kombineras med en datortomografi av kroppen, kan användas för att ta reda på om matstrupscancern har spridit sig till andra delar av kroppen. Ibland kan en endoskopi av luftröret (bronkoskopi) också behövas om man misstänker att cancern har spridit sig till luftvägarna.
Blodprov tas för att kontrollera förekomsten av magcancerrelaterad anemi samt lever- och njurfunktionen. Tumörmarkören CEA kan också vara förhöjd, särskilt vid framskriden adenokarcinom i matstrupen.