​Borrelioosi todetaan aluksi taudinkuvan perusteella. Tiedot mahdollisista puutiaisenpistoista tai liikkumisesta luonnossa ja puutiaisalueilla ovat tärkeitä johtolankoja. Ihoborrelioosi voidaan tunnistaa ja hoitaa ilman mitään lisätestejä. Kun epäillään levinnyttä borrelioosia, potilaan verinäytteestä tutkitaan borreliavasta-aineet. Jos ne ovat selvästi koholla, ne vahvistavat yhdessä taudinkuvan kanssa borrelioosin diagnoosin.

Borrelioosia ei voida todeta pelkkien vasta-aineiden perusteella, koska vasta-aineet voivat säilyä pitkään parantuneen borrelioosin jälkeen. Vasta-aineiden tasosta ei voida luotettavasti päätellä antibioottihoidon tehoa.

Silloin kun tutkitaan keskushermoston borrelioosia, otetaan yleensä aivoselkäydinnestenäyte, josta etsitään merkkejä tulehdusreaktiosta tai borrelivasta-ainetuotannosta diagnoosin vahvistamiseksi. Ääreishermoston borrelioosissa nämä löydökset voivat kuitenkin olla vähäisiä.

Jos nivelturvotuksen taustalla epäillään borrelioosia, vasta-aineet ovat yleensä selvästi koholla. Borrelian nukleiinihappoa voidaan etsiä nivelnesteestä. Silloin turvonneesta nivelestä otetaan nivelnestenäyte nivelrakoon pistämällä.

Borrelioosin diagnostiikassa lymfosyyttistimulaatiotestit tai CD57-määritykset eivät ole luotettavia.