Borrelioosi todetaan aluksi taudinkuvan perusteella. Tiedot mahdollisista puutiaisenpistoista tai liikkumisesta luonnossa ja puutiaisalueilla ovat tärkeitä johtolankoja. Ihoborrelioosi voidaan tunnistaa ja hoitaa ilman mitään lisätestejä. Kun epäillään levinnyttä borrelioosia, potilaan verinäytteestä tutkitaan borreliavasta-aineet. Jos ne ovat selvästi koholla, ne vahvistavat yhdessä taudinkuvan kanssa borrelioosin diagnoosin.
Borrelioosia ei voida todeta pelkkien vasta-aineiden perusteella, koska vasta-aineet voivat säilyä pitkään parantuneen borrelioosin jälkeen. Vasta-aineiden tasosta ei voida päätellä antibioottihoidon tehoa.
Silloin kun tutkitaan neurologisten oireiden yhteyttä borrelioosiin, otetaan yleensä aivo-selkäydinnestenäyte, josta etsitään merkkejä tulehduksesta ja borrelivasta-ainetuotannosta diagnoosin vahvistamiseksi. Ääreishermoston borrelioosissa nämä löydökset voivat kuitenkin olla vähäisiä.
Borrelioosin aiheuttaman niveltulehduksen yhteydessä veren borreliavasta-aineet ovat yleensä selvästi koholla. Pelkkä nivelkipu ilman nivelen turvotusta ei ole merkki borrelioosista. Nivelborrelioosia epäiltäessä turvonneesta nivelestä otetaan nivelnestenäyte nivelrakoon pistämällä. Nivelnestenäytteestä voidaan etsiä borreliabakteerin nukleiinihappoa.
Borrelioosin diagnostiikassa lymfosyyttistimulaatiotestit tai CD57-määritykset eivät ole luotettavia.