Borrelios konstateras först på grundval av sjukdomsbilden. Information om eventuella fästingbett eller vistelser i naturen och fästingområden är viktiga ledtrådar. Hudborrelios kan identifieras och behandlas utan ytterligare tester. När man misstänker utbredd borrelios, testas patientens blodprov för borreliaantikroppar. Om de är tydligt förhöjda bekräftar de tillsammans med sjukdomsbilden borreliosdiagnosen.
Borrelios kan inte diagnostiseras enbart på basis av antikroppar, eftersom antikroppar kan finnas kvar länge efter tillfrisknandet. Nivån av antikroppar är inte en tillförlitlig indikator på antibiotikabehandlingens effekt.
När man utreder sambandet mellan neurologiska symtom och borrelios tas vanligen ett cerebrospinalvätskeprov, där man söker tecken på inflammation och borreliaantikroppsproduktion för att bekräfta diagnosen. Vid borrelios i det perifera nervsystemet kan dessa fynd dock vara sparsamma.
Vid ledinflammation orsakad av borrelios är borreliaantikropparna i blodet vanligen tydligt förhöjda. Enbart ledvärk utan svullnad i leden är inte ett tecken på borrelios. Vid misstanke om led-borrelios tas ett ledvätskeprov från den svullna leden genom punktion av ledhålan. I ledvätskeprovet kan man söka efter borreliabakteriens nukleinsyra.
Lymfocytstimuleringstester eller CD57-analyser är inte tillförlitliga vid diagnostiken för borrelios.