Vid prostatacancer är plasmanivåerna av den prostataspecifika antigenen PSA förhöjda (PSA ”läcker” från cancercellerna till blodcirkulationen), men PSA höjs också vid tillstånd som godartad prostataförstoring och infektion. Därför betyder ett PSA-värde som ligger över referensvärdena inte automatiskt att det är fråga om prostatacancer, utan mätningen bör vanligtvis upprepas. Som stöd till PSA-värdet kan man mäta andelen fritt PSA, som meddelas i procent. Ju lägre procentandel fritt PSA, desto större misstanke om prostatacancer. Gränsvärdet för fortsatta undersökningar är vanligtvis lägre än eller lika med 15 procent.
Diagnosen prostatacancer baseras på vävnadsprov som tas från prostatan genom nålbiopsi med hjälp av ultraljud via ändtarmen. Före ingreppet får patienten antibiotika för att förhindra infektion. Prostatan bedövas innan man tar proven. Undersökningen tar totalt cirka 20 minuter och man behöver inte sjukskriva sig efter ingreppet. Ingreppet är vanligtvis helt smärtfritt. De vanligaste biverkningarna är lite blod i urinen och blodig sperma.
Det har blivit allt vanligare att göra en magnetundersökning av prostatan redan i diagnosskedet och ta så kallade riktade biopsier av onormala vävnadsområden som upptäcks vid magnetundersökningen. En patolog undersöker om det finns cancer i vävnadsproven. Om patologen hittar cancer bedömer han eller hon cancerns aggressivitet med hjälp av den internationella Gleason-graderingen. Gleason-graderingen är en av de viktigaste prognosfaktorerna för prostatacancer.